[[1551]] m. sunkios, nežinomos ligos pakirsta, ji mirė. Ji buvo palaidota katedros rūsyje, greta pirmosios Ž. Augusto žmonos – Elžbietos. Žygimantui Augustui Barboros mirtis padarė didelį įspūdį. Savo gyvenamųjų kambarių sienas jis liepė juodai išmušti, visas dvaras paskendo gedule.
Po antrosios žmonos mirties Žygimantas Augustas tikėjosi susilaukti įpėdinio ir ieškojo žmonos. Norint užkirsti kelią galimai Habsburgų Šventosios Romos imperijos ir Maskvos sąjungai buvo pasirinkta pirmosios žmonos sesuo, našlaujanti Mantujos kunigaikštienė [[Kotryna Habsburgaitė|Kotryna Habsburgaitė]] ([[1553]] m.). Su ja Žygimantas Augustas vaikų neturėjo ir nuo 1562 m. gyveno atskirai.<ref>J.Kiaupienė, I. Lukštaitė ''Lietuvos istorija: V tomas''. Vilnius, 2013. P. 62-63</ref>
Karaliaus įpėdinio klausimas buvo labai svarbus tiek šalies protestantams, tiek katalikams. Protestantai tikėjosi, kad karalius išsiskirs ir ves dar kartą taip sukeldamas santykių su Roma krizę. Tokio žingsnio Žygimantas Augustas nežengė. Su savo favoritėmis Barbara Giżanka ir Anna Zajączkowska karalius vaikų taip pat neturėjo. Kotryna Habsburgaitė mirė 1572 m. vasario mėn., tačiau po mažiau nei 6 mėnesių mirė ir pats karalius.
