DNR išskyrimas: Skirtumas tarp puslapio versijų
Ištrintas turinys Pridėtas turinys
Nėra keitimo santraukos |
Nėra keitimo santraukos |
||
Eilutė 10:
Tačiau DNR molekulė nėra atspari fizinėms jėgoms, ypač šoninėms bei hidrodinaminėms. Tirpale dvispiralė DNR yra atsitiktinai susivyniojusi į kamuoliuką, kurį sustiprina vandelnilinės jungtys tarp bazių ir elektrostatinis atstūmimas tarp neigiamai įkrautų fosfatinių grupių. Kuo ilgesnė DNR molekulė, tuo silpnesnės hidrodinaminės jėgos gali ją sufragmentuoti. Po standartinių DNR išskyrimo procedūrų dažniausiai gaunamos ~100-150 (200) kb ilgio DNR fragmentų mišinys. Jie tinka Sounthern'o analizei, [[PGR]] bei [[genomas|genominių]] bibliotekų kūrimui naudojant bakteriofagų vektorius.
Fiziologinėmis sąlygomis dauguma DNR yra B formos (sukasi palei aikrodžio rodyklę, turi 10 bp (bazių porų) per vieną apsisukimą, apsisukimas lygus 3,4 nm).
==Principas==
Trys pagrindiniai DNR išskyrimo etapai:
*Ląstelių ir branduolio lipidinės membranos suardymas trinant, ultragarsu ar detergentais (SDS - Natrio dodecil/lauryl sulfatas); IGEPAL/NONIDET.
*Viduląstelinių ir histoninių [[baltymai|baltymų]] pašalinimas pridėjus proteinazę K ir juos precipituojant pridėjus [[natris|natrio] ar amonio acetato, arba taikant fenolio-chloroformo-(izoamilo alkoholio) išskyrimo etapą (susidaro dvifazis tirpalas: DNR (ir kt. druskos) ištirpsta vandeninėje fazėje, o baltymai lieka organinėje fazėje; žingsniai kartojami; gali būti naudojamas tirpalas 25:24:1).
*DNR precipitacija paveikus šaltu 96º etanoliu ar izopropanoliu (izopropilo alkoholiu) (DNR netirpsta alkoholyje ir iškrenta į nuosėdas; taip pat yra pašalinamos druskos)
**Vėliau DNR kelis kartus perplaunama alkoholiu (70, 96º [[etanolis|etanoliu]])džiovinama ir užpilama TE [[buferis|buferiu]] (šarminis buferis) arba laikoma -20 ištirpinta etanolyje (DNR bankas).
Iš 20 ml veninio kraujo išsiskiria apie 250 mkg DNR (branduolinė + mitochondrinė).
| |||